Carbohydrate Polymers | 內切木聚糖酶透過轉糖基作用將木聚糖快速水解為主要產物木二糖

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今天推送的文章是2020年6月發表在Carbohydrate Polymers上的“An endoxylanase rapidly hydrolyzes xylan into major product xylobiose via transglycosylation of xylose to xylotriose or xylotetraose”,通訊作者是中國農業大學生物學院的姜偉教授。

內切木聚糖酶因其水解特性而被廣泛應用於工業,特別是在益生元低聚木糖 (XOSs) 的生產中。XOS 不被腸道細菌吸收;相反,它們往往會增加有益腸道微生物的數量,例如乳酸桿菌和雙歧桿菌。重要的是,XOS(尤其是木二糖)對人體消化系統基本上無毒,並顯示出有益的特性,例如促進益生菌的產生、降低膽固醇水平和增強生物鈣吸收。本文研究了一種新的來源於

T。 asperellum ND-1

內切木聚糖酶Taxy11,透過改造畢赤酵母中的 N 端訊號肽,Taxy11 的表達水平顯著增強。透過定點突變確定了 Taxy11 活性的基本催化位點,闡明瞭木二糖生產的新催化機制,並評估了 Taxy11 將玉米芯木聚糖轉化為富含木二糖的 XOS 的能力。

Taxy11 被歸類為糖苷水解酶家族 GH11 的成員。透過將密碼子適應指數(CAI)從 0。57 升級到 0。83,對xyl基因進行了最佳化,GC 含量相對於天然序列從 57。3% 降低到 38。9%。異源蛋白質的高效生產取決於密碼子最佳化、工程啟動子(質粒)和蛋白質分泌。因此,評估了密碼子最佳化和前肽插入對 Taxy11 活性的影響。構建了重組菌株α-XYL,p-oXYL,α-oXYL,培養 132 小時後Taxy11 活性水平分別為 195。66 ± 8。01、163。27 ± 9。74 和 116。19 ± 9。31 U/mL。p-oXYL 的胞外Taxy11活性最高,比野生型 α-XYL 高 68。40%。由於基於密碼子最佳化基因的更高的蛋白質分泌和生物量積累,工程菌株 α-oXYL 的Taxy11活性顯著(40。52%)高於重組菌株 α-XYL。

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使用櫸木木聚糖評估了其水解活性,Taxy11對櫸木木聚糖的初始水解產物主要由木四糖和木三糖組成,終產物為木二糖和木三糖。使用標準木糖和 XOSs (木二糖、木三糖、木四糖和木五糖)作為底物研究了作用模式。Taxy11迅速水解木五糖或木四糖生成木二糖和木三糖作為主要終產物。木三糖水解產生大量木二糖和少量木糖。在木三糖水解過程中檢測到木四糖,在木四糖水解過程中檢測到木五糖,表明木三糖或木四糖在酶的轉糖基化作用下轉化為木二糖。未觀察到酶對木糖或木二糖的活性。

木聚糖酶的轉糖基化在之前的研究中也有報道。然而,不同的木聚糖酶在不同底物的存在下具有不同的轉木糖基化能力。使用木五糖作為底物,青色鏈黴菌來源的木聚糖酶 A (Xln A ) 合成了從木六糖到比木八糖更大的木寡糖苷的產物;而來自木聚糖熱桿菌的木聚糖酶(Tx-xyn11)僅在多酚受體存在下發生轉木糖基化反應。本研究中Taxy11的轉糖苷反應以木三糖/木四糖為轉糖受體,木糖為供體,形成相應的木四糖/木五糖中間體,得到主要終產物木二糖。由於其獨特的轉糖基化模式,木聚糖酶可以廣泛應用於各個領域,例如木糖基衍生物的酶促合成和有價值的生物分子(益生元、XOS)的生產。

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使用玉米芯木聚糖作為底物評估由 p-oXYL 表達的 Taxy11 的水解效率。HPLC 分析表明水解產物中的木二糖比例在最初的 0。5 小時內迅速增加,在短時間內大量生產木二糖是 Taxy11的獨特性質。0。5 小時後木二糖生產率降低可能是由於最終產物抑制導致 Taxy11 活性降低或木聚糖中的分支點和阿拉伯糖修飾導致木聚糖中易於接近的水解位點水平降低。相比之下,木五糖和木四糖的比例分別急劇下降至 7。72±0。06% 和 7。86±0。04%,表明 Taxy11 有效地將高聚合度的XOS水解成木二糖。此外,木糖的產量可以忽略不計。因此,將 Taxy11 用於從可溶性玉米芯木聚糖生產富含木二糖的 XOS 是一種有用的、具有成本效益的策略。

根據與木聚糖酶晶體結構的多序列比對,透過定點突變設計並構建了Taxy11突變體,以確定發揮催化活性的位點。突變體 E31A、E140A 和 D149A 的酶活性與正常木聚糖酶 (Taxy11) 的酶活性非常相似,但 D203A 和 D53A 的酶活性大大降低(分別降低了約 60% 和 90%)。未檢測到 E210A 或 E119A 的酶活性。

HPLC 分析顯示 E31A、E140A、D203A 和 D149A 具有很強的櫸木木聚糖和 XOSs 降解能力,但對 E210A、E119A 或 D53A 則沒有。這些發現綜合起來表明,Glu119、Glu 210和Asp 53是Taxy11 活性的必要催化位點,而Asp 203可能起輔助作用。

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基於構建的模型,透過各種底物與Taxy11蛋白質結構的分子對接,進一步闡明瞭催化機制。根據模型,木三糖、木四糖和木聚糖被插入位於Glu119、Glu210、Asp53和Asp203位點之間的催化區域。對於木四糖的水解,Taxy11催化殘基的Glu 210和Glu 119水解木四糖生成木糖和木三糖。Glu 210和 Asp 53促進了中間體(木五糖)的產生,並透過催化位點(Glu210和 Glu119)進一步降解,產生木二糖和木三糖作為主要的水解產物。對於木三糖,Glu 210和 Glu 119將木三糖降解為木糖和木二糖,然後Glu 210和Asp 53促進新的底物(木糖和木三糖中間體—木四糖)的形成,並進一步降解產生木二糖。

Taxy11 催化機制涉及將木糖轉糖基化為可進一步作為底物的木三糖或木四糖,分別形成木四糖或木五糖中間體。Glu203-Glu119、Glu203 -Glu210和Asp203 -Asp53的殘基間距分別為10。9、14。8和21。1 Å ,為木二糖/木三糖(Glu203-Glu119和 Glu203-Glu210之間)和木四糖/木五糖(Glu203-Glu210和Asp203-Asp53之間)的定位提供了足夠的空間。

Taxy11 的木聚糖到木二糖催化機制的模型如下圖所示。基本催化位點(Glu210、Glu119)負責降解,而Glu210、Asp53是轉糖基化反應的關鍵位點。根據以往研究推測的木聚糖酶水解和轉糖基化過程,本研究提出了一種新的木四糖水解機制:2 X4 + E = 2 X4(E);2 X4(E) = X3 + (X1 + X4)(E);(X1 + X4)(E) + X3 = X5(E) + X3;X5(E)+X3=X2+2X3+E(其中2X4代表兩個木四糖;E為遊離的Taxy11;X4(E),為Taxy11木四糖複合物)。

對於 Taxy11 對木三糖的水解,水解產物中存在木四糖,這表明木四糖的形成是轉糖基化的結果。總反應為:2 X3 + E = 2 X3(E);2 X3(E) = (X1 + X3)(E) + X2;(X1 + X3)(E) + X2 = X4(E) + X2;X4(E)+X2=3X2+E。Taxy11 對木糖的強轉糖基化能力可能是由於Glu203 -Glu 210和Asp 203 -Asp 53的殘基間距為木三糖/木四糖的轉糖基化反應提供了足夠的空間。根據現有的木聚糖酶晶體結構(EMBD id:EMD-8218),Glu119 , Glu210 , Asp53 , Asp203之間的距離為 XOSs (DP > 2) 的水解提供足夠的空間,以產生主要的木二糖。這些概念與定點突變、HPLC 分析、蛋白質結構以及 Glu119、Glu210和 Asp53在木聚糖水解產生主要產物木二糖中的關鍵催化作用一致。

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本研究表徵了來自

T。 asperellum ND-1

的新型木聚糖內切酶 (Taxy11) ,並提出了一種增強Taxy11活性的有效策略。定點突變分析表明,Taxy11 的Glu119、Glu210和 Asp53是關鍵的催化位點,Asp203起輔助作用。給出了Taxy11 將木聚糖降解為木二糖的原理模型。Taxy11 獨特的催化機制將玉米芯木聚糖快速轉化為木二糖,這表明在從農業廢棄物生產XOS(富含木二糖)方面具有強大的應用潛力。

End

整理:董如月

DOI:10。1016/j。carbpol。2020。116121