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研究背景
超解析度顯微鏡技術提供了亞衍射極限的解析度，與傳統的共焦顯微鏡相比，解析度提高了2到10倍。光學顯微鏡解析度的這一突破為神經科學和突觸生物學的新發現做出了貢獻。本文綜述了結構照明顯微鏡（SIM）、受激發射損耗顯微鏡（STED）和隨機光學重構顯微鏡（STORM）/單分子定位顯微鏡（SMLM）技術，並對它們進行了比較，以更好地理解它們之間的差異及其在突觸生物學分析中的適用性。本文還就這些顯微技術的實用層面進行了討論，包括解析度、影象採集速度、多色能力及其他優缺點。此外，本文還總結了超解析度顯微鏡如何用於分析神經肌肉接頭和突觸的方法。
神經肌肉接頭 （NMJ） 是在運動神經元和肌肉纖維之間形成的大型突觸。由於它們的大尺寸和可訪問性，這些突觸已經被研究人員們使用組織學和生理學的方法進行了非常廣泛的研究。即使針對這些突觸的研究歷史已經非常悠久了，但近來超解析度顯微鏡的出現和投入使用，還是使得這類研究有了新的發現。
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研究介紹（節選）
一、SIM、STED 和 STORM 超解析度顯微鏡的優缺點
1、解析度
超解析度顯微鏡提供亞衍射極限解析度，優於約 200 nm 的共聚焦顯微鏡的解析度。在神經生物學中，共聚焦顯微鏡可以對軸突和神經、樹突樹狀形態、線粒體形態、細胞核、突觸和 NMJ 進行成像。然而，超解析度顯微鏡可用於對棘的詳細結構、Ranvier 節點中的蛋白質分佈模式、核孔蛋白質、突觸前和突觸後蛋白質的亞突觸定位以及突觸囊泡進行成像。
以NMJ為例，NMJ的正面檢視很大，尺寸範圍約為 10 – 60 μm（人類、小鼠）； 然而，這種突觸的一些關鍵特徵的尺寸低於 200 nm 的衍射極限解析度。例如，突觸囊泡為 55 nm，活動區為 50 – 100 nm，突觸間隙為 50 – 100 nm；此外，結折峰寬度為 207 nm，開口寬度為 55 nm （圖1），層粘連蛋白長度為 77 nm，Lrp4 蛋白長度約為 60 nm。因此，分析這些特徵需要提高超解析度顯微鏡的解析度。
圖1、阿貝的衍射極限，突觸結構的大小以及用於超解析度顯微鏡的工具
這三種技術的 XY 平面解析度如下：SIM，120 nm，STED 和 STORM，20 – 30 nm （表1）。與共聚焦顯微鏡相比，它們的解析度顯著提高，共聚焦顯微鏡在 XY 平面上的解析度約為 200 nm，沿 Z 軸的解析度約為 500 nm（對於使用 NA=1。4 透鏡觀察到的綠色熒光染料）。因為焦區較寬，共聚焦顯微鏡的 Z 軸解析度低於 XY 解析度。超解析度顯微鏡技術的 Z 軸解析度如下：SIM，300 nm，STED，75 – 100 nm（Easy 3D，STED 3×）和 STORM，50 nm（STORM 3D）。
除了解析度的差異之外，這三種技術在提高解析度的機制上也有所不同。SIM 和 STORM 基於原始資料顯微照片的後處理來重建超解析度影象，STED 顯微鏡使用應用於原始資料顯微照片的傅立葉變換生成超解析度影象。STED 顯微鏡透過在樣品上掃描鐳射束來生成超解析度影象，類似於共聚焦顯微鏡。STORM 透過收集數千張顯微照片並使用高斯分佈近似和分配點來重建它們，類似於點畫法，從而生成超解析度影象。
表1、超解析度顯微鏡規格比較
2、顏色數
與傳統的熒光顯微鏡技術類似，超解析度顯微鏡可以使用多種顏色進行。SIM 的影象構建依賴於對 9 到 15 個採集到的具有莫爾條紋的影象進行後處理；因此，如果激發和發射波長在熒光團之間分離，則可以進行多色成像。
在 STED 顯微鏡中，透過用激發鐳射掃描樣品並獲取每個熒光團的發射波長來生成類似於共聚焦顯微鏡的影象。與共聚焦顯微鏡的區別在於需要將熒光團的發射波長與 STED 鐳射的波長相匹配，以將激發的熒光團耗盡至基態。
STORM 需要高強度光下在非發射狀態和基態之間切換的熒光團，以及用於這些切換熒光團的專用緩衝環境。熒光團隨機弛豫到基態，然後被激發發射熒光。具有這些特性的熒光團稱為光可切換（光閃爍）染料（對於 STORM）和可光切換熒光蛋白（對於 PALM）。dSTORM 或無啟用劑 STORM方法允許使用與二抗偶聯的市售光可切換染料，而無需啟用劑-報告劑對染料，這有利於多色分析。三色 STORM 分析透過將 STORM 與光譜分離（光譜解混）方法相結合，來解析具有重疊發射光譜的熒光團。
3、成像速度和實時成像
商用 SIM 顯微鏡的時間解析度與 STED 顯微鏡相似，優於 STORM，因為 SIM 重建超解析度影象所需的原始顯微照片數量僅為 9 到 15 張，而 STORM 則需要數萬張。此外，與 STED 和 STORM 相比，SIM 需要較低的成像光強度。SIM 實時成像目前用於分析各種神經系統結構，包括培養神經元的生長錐、生長錐細胞骨架和囊泡、培養的海馬神經元的樹突棘，以及大腦中的樹突和樹突棘，活斑馬魚幼蟲或活老鼠。
STED 顯微鏡類似於共聚焦顯微鏡，兩者都是掃描顯微鏡。點掃描顯微鏡允許對較小的區域或線進行成像，以提高時間解析度，而不是掃描整個視野。STED顯微鏡實現了影片速率的快速實時成像；例如38。5 FPS用於分析囊泡融合和內吞作用，28 FPS用於分析神經元中的突觸蛋白 。
STORM （PALM， SMLM） 成像速度約為 0。1 FPS，因為需要數萬幀（顯微照片）來重建超解析度影象，比 SIM 和 STED 的時間解析度低。目前，已經開發了多種演算法來提高STORM的時間解析度，包括識別可能具有重疊點擴散函式的分子位置的多發射體擬合算法。STORM 已與 TIRF 顯微鏡相結合，因此具有低於 1 微米的淺成像深度，使用 STORM 可以對幾微米到 30 微米厚的切片進行成像。
目前各種超解析度顯微技術基本都可以實現商用，但是每種技術都有優缺點，在選擇用於專案的方法之前，需要綜合考慮。例如，如果專案需要最高解析度，STORM 和 STED 可以提供目前商用超解析度顯微鏡（橫向解析度為 20 至 30 nm）的最佳解析度。如果專案需要蛋白質數量資訊，STORM 已被證明可以提供定量資訊。
二、超解析度顯微鏡型別對突觸分析的適用性
1、用於 NMJ 分析的 SIM
三維結構照明顯微鏡 3D-SIM已用於分析大銜接蛋白 Ankyrin2-L透過調節突觸前微管和細胞粘附分子在穩定果蠅幼蟲 NMJ 中的作用。3D-SIM 揭示了一個重複的晶格結構，其週期性約為 200 nm，由軸突中的 Ankyrin2-L 和 β-spectrin 組成，但在突觸前 boutons 中的組織結構較差。
透過在小鼠 NMJ 中使用 3D-SIM，分析突觸蛋白的分佈模式，包括突觸前活性區蛋白 Piccolo 和突觸後蛋白 rapsyn、電壓門控鈉通道和整合素 α7，相對於突觸後連線摺疊的分佈模式進行了分析。與之前的報道一致，這些蛋白質是在 NMJ 的預期位置觀察到的。
2、用於 NMJ 分析的 STED 顯微鏡
超解析度顯微鏡在 NMJ 分析中的首次應用是使用 STED 顯微鏡對果蠅NMJ 的活動區進行成像。活動區是突觸前膜上的突觸囊泡釋放位點。活動區域在電子顯微鏡影象中顯示為果蠅NMJ 中的 T 條或脊椎動物 NMJ 中的小聚集體。先前透過共聚焦顯微鏡顯示該蛋白質在運動神經末梢以點狀分佈，每個淚點內沒有任何明顯結構。STED 顯微鏡的亞衍射極限解析度首次揭示了每個淚點內的結構，並闡明瞭每個淚點中 Bruchpilot 蛋白的環狀模式。
表2、用於 NMJ 分析的超解析度顯微鏡技術
3、STORM 用於 NMJ 分析
與 STED 顯微鏡類似，STORM 最初用於分析果蠅幼蟲 NMJ。使用直接隨機光學重建顯微鏡 （dSTORM） 定量分析果蠅幼蟲 NMJ 的活動區。作為單分子定位顯微鏡方法，dSTORM 用於定量內源性蛋白質。活性區特異性 Bruchpilot 蛋白的數量估計為每個活性區 137 個蛋白質，這些蛋白質的四分之三被組織成大約 15 個不同的位置，每個位置有 7 個 Bruchpilot 蛋白。這種定量 dSTORM 技術成功地顯示了 Rab3 突變幼蟲 NMJ 中每個活性區的 Bruchpilot 蛋白數量增加了大約 60%。此外，STORM 被用來分析 Bruchpilot 和 synaptotagmin 在快速穀氨酸釋放中的作用以及 Bruchpilot 和絡合蛋白在將突觸囊泡束縛到果蠅的活躍區中的作用幼蟲 NMJ。
在小鼠 NMJs中，基於 STORM 影象，作者提出了一種新的乙醯膽鹼受體分佈模式，其中受體濃度在交界褶口的肩部較高，但在脊部較低。這種分佈模式與經典理解略有不同，其中乙醯膽鹼受體被認為分佈在交界褶皺脊的頂部和肩部，而不是褶皺的底部。
作者使用 STORM 比較了人和小鼠 NMJ 以分析突觸體相關蛋白 25 （SNAP25） 的分佈模式。在小鼠 NMJs 中，SNAP25 以點狀方式分佈，其密度（每 μm 2 15 ）類似於活性區蛋白 Bassoon 和 Piccolo 的點狀密度（每 μm 10 2）。有趣的是，與小鼠 NMJ 相比，人類 NMJ 在淚點大小、每個 NMJ 區域的淚點密度和免疫組織化學的訊號強度方面顯示出更大的 SNAP25 值。基於這些發現，作者提出人類和小鼠 NMJ 之間存在差異。
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研究結論
果蠅 NMJ 的超解析度顯微鏡研究已經取得了長足的進步，並揭示了令人印象深刻的奈米結構和以前在電子顯微照片中被稱為 T 型條的活性區的分子特性。良好的分子標記（例如，活躍區的 Bruchpilot）和豐富的遺傳突變資源的結合為使用超解析度顯微鏡研究果蠅 NMJ 生理修飾的分子機制提供了豐富的機會。哺乳動物 NMJ 的超解析度顯微鏡研究仍處於起步階段。據我們所知，這些超解析度方法尚未用於脊椎動物 NMJ 的實時成像。然而，已經使用電子顯微鏡斷層掃描在青蛙和小鼠中研究了脊椎動物 NMJ，揭示了突觸前活動區的超微結構細節。超解析度顯微鏡提供了揭示這些建模結構的分子身份的機會，以便更好地瞭解脊椎動物突觸，超解析度顯微鏡的發展提高了對支撐分子機制的理解。
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超高解析度顯微成像系統
iSTORM
前文中提及的隨機光學重構顯微鏡（STORM）技術，目前已成功實現商用。超高解析度顯微成像系統 iSTORM，成功實現了光學顯微鏡對衍射極限的突破，使得在 20 nm的解析度尺度上從事生物大分子的單分子定位與計數、亞細胞及超分子結構解析、生物大分子生物動力學等的研究成為現實，從而給生命科學、醫學等領域帶來重大性突破。
圖2、超高解析度顯微成像系統iSTORM。
超高解析度顯微成像系統 iSTORM 具有 20 nm超高解析度、3通道同時成像、3D同步拍攝、實時重構、2小時新手掌握等特點，已實現活細胞單分子定位與計數，並提供熒光染料選擇、樣本製備、成像服務與實驗方案整體解決方案，以奈米級觀測精度、高穩定性、廣泛環境適用、快速成像、簡易操作等優異特性，獲得了超過50家科研小組和100多位科研人員的高度認可。
參考文獻：
Badawi Y， Nishimune H。 Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses。 Neurosci Lett。 2020 Jan 10；715：134644。 doi： 10。1016/j。neulet。2019。134644。 Epub 2019 Nov 22。 PMID： 31765730； PMCID： PMC6937598。
延伸 · 閱讀
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【文獻解讀】用於活細胞奈米觀察的無籠基團光啟用熒光團的通用設計策略
□【文獻解讀】大腸桿菌相關超高分辨成像
□【文獻解讀】STORM成像揭示四膜蟲睫狀體基部過渡帶成分和IFT顆粒的空間排列
