腺相關病毒AAV載體的製備與表徵

由於不插入宿主基因組、免疫原性低，同時宿主範圍廣、表達時程長、在體感染特異性好等特點，使腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）正成為廣泛使用的基因治療病毒載體之一。目前，已經有三款基於AAV載體的基因治療藥物上市，且有百多項AAV載體基因治療臨床試驗在全球開展。因此開發穩定的AAV病毒生產工藝對研發、臨床研究及商品化都非常重要。

2022年2月18日/醫麥客新聞 eMedClub News/——

AAV的生產通常使用三質粒共轉染法，三質粒系統在293T細胞中進行包裝，然後採用機械或化學裂解的方法從細胞中收穫AAV載體，細胞裂解後，可使用Benzonase處理，降低粘度，去除遊離的核酸，對於科研級應用，傳統採用密度梯度超速離心進行純化，對於大規模培養，使用一次性生物反應器進行GMP級生產，收穫階段使用深層過濾或切向流過濾去除不溶性細胞成分，然後再用多步層析提高AAV載體純度，在除菌過濾之前選擇切向流過濾濃縮病毒載體，從而達到製劑濃度。在生產工藝中，丹納赫旗下Pall及Cytiva具有質粒發酵及AAV載體制備的完整解決方案。

AAV載體的工藝流程解決方案

在AAV載體的生產工藝上，對載體生產的純度有很高要求。AAV空病毒衣殼不含有治療基因但會引起免疫反應，而且空衣殼會和完整衣殼競爭感染患者細胞，若要達到治療效果就需要加大劑量，會帶來高劑量副作用。所以用合適的方法檢測AAV載體生產中的空殼率是也目前亟待解決的問題。採用貝克曼庫爾特的分析型超速離心機AUC進行空殼率檢測是有效的手段之一。由於AAV空衣殼與完整衣殼的分子量相差非常小，所以需要採用高分辨的方法進行檢測。AUC採用沉降速率法，可區分及量化空載體、全基因組載體、部分組裝載體、聚集狀態的載體及其他雜質碎片等，且AUC方法不需要更換溶液體系及對樣品進行標記，不會對樣品造成破壞，並適用於不同血清型AAV載體。

AUC對rAAV顆粒狀態進行檢測（Wang et al. (2019). Mol Ther Methods Clin Dev, 15, 257-263.）

此外，SCIEX的PA800 Plus毛細管電泳製藥分析系統亦可對AAV的不同組裝狀態進行分析。由於AAV衣殼表面的氨基酸側鏈會造成AAV具有特定的等電點（Isoelectric Point，pI），其內部核酸的填充情況也會造成AAV等電點的差異，同時不同的血清型也可影響產品的等電點，所以透過用等電聚焦電泳模式對AAV載體進行pI值檢測可用於AAV的種類鑑別及組裝情況的分析。

樣品AAV 10的等電點檢測電泳圖譜

用毛細管電泳還可進行AAV的衣殼蛋白純度分析及宿主細胞殘留DNA（HCD）的片段分佈檢測。AAV衣殼由三種結構蛋白（VP1、VP2和VP3）組成，其比例和純度都會影響藥物的效能和效價，需要被鑑定並監控以確保藥物質量，且AAV產品具有多種血清型，普遍濃度較低，需要一種針對不同血清型均具有較高分離度和靈敏度的分析方法。PA800 Plus採用鐳射誘導熒光的檢測方式對AAV衣殼蛋白的結構蛋白進行純度檢測，可將VP1、VP2、VP3進行基線分離，檢出限可達1×109 GC/mL。

CE-SDS-LIF方法分析AAV 10的衣殼蛋白純度

FDA關於人類基因治療新產品生產指導檔案中明確指出HCD的片段要小於200 bp；NMPA生物製品藥學部同樣在基因治療產品藥學研究與評價技術指導原則的徵求意見稿中指出，HCD的片段要小於200 bp。PA800 Plus用鐳射誘導熒光的檢測方式可檢測10pg/mL的DNA片段濃度，若在前處理的過程中對DNA進行濃縮處理，還可獲得更高的檢測靈敏度，同時可檢測50bp-1000bp的片段大小，且可進行條件最佳化檢測長至15kb的片段大小，滿足各種殘留DNA檢測的要求。