新的直接RNA奈米孔測序方法可在單分子水平上對直接RNA結構分析

挪威卑爾根大學的研究人員及其合作者開發了一種新方法，利用奈米孔測序在單分子水平上對RNA結構進行分析。

該方法被命名為單分子結構測序（SMS-seq），相關研究報告於9月發表在《Nucleic Acids Research》上。該方法將一種新的化學結構探測方案與直接RNA奈米孔測序相結合，擴大了在單分子水平上研究RNA結構的工具包，而不需要逆轉錄和PCR。

卑爾根大學計算生物學教授、該論文的通訊作者Eivind Valen說：“RNA結構在許多分子中極其重要。我們想弄清楚的是我們能從單個RNA分子中獲得多少資訊。”

以前，RNA結構大多是透過結構依賴的化學探測，然後是短讀測序來檢測。在這些實驗中，RNA分子被標記為可以修改核糖2′-羥基的化學品（如透過引物延伸分析的選擇性2′-羥基醯基（SHAPE）試劑）或可以標記核鹼的化學品，包括硫酸二甲酯（DMS）。

在cDNA合成過程中，化學修飾的RNA可能導致逆轉錄終止或鹼基誤入，然後可以透過測序捕獲。這樣的資訊可以幫助科學家透過計算推斷出RNA結構。

然而，正如該研究指出的那樣，短讀測序方法有幾個限制。例如，由於讀長的限制，這些方法不能有效地實現較大RNA分子的全長結構分析，如信使RNA和核糖體RNA。此外，需要PCR擴增意味著這些方法通常不能捕獲RNA分子上的原生修飾，不能在單分子水平上分析RNA結構。

為了克服這些瓶頸，Valen和他的團隊試圖將RNA結構探測與直接RNA奈米孔測序相結合。研究人員最初嘗試使用SHAPE試劑和DMS，然而，他們發現這兩種化學探測方案導致了‘低質量、截斷和不可應用的序列’。

這是因為SHAPE試劑修改了RNA骨架，而且‘相當笨重’，所以修改後的RNA分子不能非常有效地透過孔隙。

對於研究人員來說，理想的情況是，有一種東西能修改所有開放的鹼基，不使RNA退化，並能透過奈米孔並被檢測到。

為此，研究人員採用了一種新的探測方案，使用焦碳酸二乙酯（DEPC），這是一種能使RNA內未配對的腺苷發生乙氧基化的化學品，它引入了非常高的修飾水平，而不會導致明顯的RNA分解。

為了實現SMS-seq，用DEPC處理RNA分子，然後用牛津奈米孔技術公司的MinIon測序儀進行直接RNA測序。當RNA在奈米孔中遷移時，研究人員尋找對照組和修改過的樣本之間的電流訊號的偏差，以檢測RNA分子上的結構依賴性修改。由此，他們使用一個名為Tombo的計算軟體得出了腺苷的DEPC修飾位點。

總的來說，該研究顯示SMS-seq可以幫助檢測瞬時和穩定的RNA結構、二級和三級結構元素、鹼基的結構依賴性和mRNA結構特徵。

特別是，當把該方法應用於具有已知結構的合成RNA髮夾時，研究人員發現SMS-seq可以幫助揭示鹼基的共同依賴性和RNA結構的構象異質性。

作者還在核糖開關上測試了該方法，核糖開關是信使RNA分子的一個調節段，透過與小分子結合控制轉錄活性。結果顯示，在對兩個核糖開關，即焦磷酸硫胺（TPP）和鐮刀菌黃素單核苷酸（FMN）進行測試時，SMS-seq可以幫助揭示結構動態的特徵，如構象變化、短程和長程結構相互作用，以及三級RNA相互作用。

儘管該方法很有前景，但SMS-seq目前有一些限制。首先，DEPC只能在體外使用，因此不能應用於活細胞。此外，它只能修改腺苷。研究中DEPC的修改率在合成RNA樣本中約為25%，但是“理想情況下，你希望修改所有開放的東西，所以你可以得到一個完美的景觀，但我們離這一點相當遙遠。”，Valen說，

Winston Timp，他是約翰霍普金斯大學的生物醫學工程教授，說：“這是對我們可以使用奈米孔直接RNA測序來化學探測RNA結構的方法的進一步補充。通常當我們說RNA測序時，我們在做cDNA測序…用直接RNA測序，你實際上是在看RNA分子本身。”

在SMS-seq之前，包括Timp在內的研究人員已經開始探索使用奈米孔測序來實現對RNA修飾和結構的直接檢測。在今年早些時候發表的一項研究中，Timp和他的合作者描述了nanoSHAPE，一種RNA結構探測方法，它將一種名為乙醯咪唑（AcIm）的新SHAPE試劑和直接RNA奈米孔測序配對，以實現長RNA的全長結構分析。

此外，在2020年，來自新加坡基因組研究所的研究人員發表了一種名為使用奈米孔測序的RNA結構分析的方法（PORE-cupine）。在該方法中，SHAPE試劑2-甲基煙酸咪唑氮化物（NAI-N3）被用於結構探測，結合直接長讀RNA測序和機器學習來幫助檢測RNA結構。

Timp指出，與SHAPE試劑相比，DEPC的一個優點是它可以更容易操作。

“這是一種非常常見的化學品，便宜而且容易買到，可以產生很多修改。”

然而，與Valen的觀點相呼應，Timp說DEPC的缺點是該試劑只能修改腺苷，而且只能在體外發揮作用。

“如果你把RNA從細胞中取出，DEPC可能更好。如果你的RNA還在細胞裡，你就不能真正使用DEPC。”

儘管直接RNA奈米孔測序有潛在的優勢，但該技術的通量目前仍然大大低於cDNA測序，這可能是該技術的一個瓶頸。