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前言
方酸是一種骨架結構近乎正方形的有機小分子，由於能同時作為氫鍵給體和受體，方酸及其類似物具有多種生物活性，在藥物化學中的應用越來越廣泛，本文主要介紹方酸及其衍生物在藥物化學中的應用情況。
方酸及其衍生物介紹
方酸，又稱二次酸，化學名為3,4-二羥基環丁-3-烯-1,2-二酮，是一種平面芳香性結構，因其獨特而近乎完美的方形結構而得名，是有機化學中的多功能合成子
。在藥物化學領域，方酸由於具有相對的高反應活性可能引起體內毒性的風險，直到近幾年，越來越多的研究表明方酸及其類似物具有多種獨特的理化性質和藥代動力學性質，才開始受到藥物化學家的關注。
圖：方酸酸性及其共振結構
方酸是一種對稱的平面性雙質子四元碳氧化合物，具有獨特的2π擬芳香性。由於具有共振穩定的芳香性方形二價陰離子結構，方酸具有很高的雙重酸性(pKa1=0.54,pKa2=3.58)。
方醯胺是應用最為廣泛的方酸衍生物，其分子結構可透過特異性的分子識別與生物靶標形成多種相互作用，
二級方醯胺可同時作為氫鍵供體和受體或氫鍵供-受體
，因此可與生物靶標形成四個氫鍵相互作用，二級方醯胺形成氫鍵的能力也是其高熔點（275-300℃）、低水溶性的原因之一。
圖：二級方醯胺形成氫鍵能力
在基於方醯胺人工受體識別陽離子的研究中，受體具有很好的氫鍵接受能力以識別陽離子（銨離子），並且接受能力隨著複合物芳香性增加而增強；同樣，當方醯胺作為氫鍵供體識別陰離子（羧酸）時，其氫鍵供體能力同樣隨著複合物芳香性的增加而增加；當同時結合陽離子和陰離子時，複合物芳香性最高，芳香性：複合物
3
>
2
和
1
。
圖：方醯胺和脲形成氫鍵的能力比較
此外，靜電勢能研究表明，
相比於僅有單羰基的脲基片段，兩個羰基的協同作用使方醯胺能與受體產生更廣泛而有效的相互作用。
方醯胺和醯胺具有一定的相似性，但
包含兩個羰基和NH的方醯胺具有剛性平面結構因而具有獨特的性質，其中sp2雜化的氮原子提供孤對電子與π電子系統形成共軛使得這種結構異常穩定，NH和羰基的相互影響導致方醯胺可形成兩性離子結構，兩性方醯胺形成的偶極子能夠模擬α-銨離子羧酸片段作為α-氨基酸的生物電子等排體。
圖：方醯胺的結構穩定性及其兩性結構
方酸及其衍生物在藥物化學中的應用
方酸類似物是藥物化學中的優勢骨架結構，在藥物設計中具有重要應用。首先，方酸類似物通常沒有高脂溶性和低水溶性的問題，尤其是方酸或方醯胺骨架與胺或羧酸組合時，得到的化合物溶解性普遍增加，進而可作為合適的治療製劑。其次，方酸類似物可作為藥物設計中羧酸和氨基酸等的非經典電子等排體。
通常，方酸衍生物的核心結構在體內水性環境下是化學穩定的。因此基於方酸骨架的化合物具有開發成為藥物的潛力，同時也報道了許多活性分子。
N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）是離子型穀氨酸受體的一個亞型，其分子結構複雜，藥理學性質獨特，在神經系統發育和神經元迴路的形成中發揮著重要作用。
Perzinfotel
是一種有效的NMDA 受體選擇性拮抗劑，具有神經保護作用，對穀氨酸位點具有較高親和力（IC50=30nM），為了改善生物利用度，研究人員設計得到了其前藥
Perzinfotel prodrug
，半衰期和活性得到明顯提高。默沙東開發的
Navarixin
是一種趨化因子受體2（CXCR2）拮抗劑，目前處於實體瘤聯合治療的二期臨床。
圖：方酸類似物活性分子
方酸二正丁酯
SQX770
是一種治療口唇皰疹的藥物，目前處於處於二期臨床。正大製藥開發的
Pibutidine
是一種組胺H2受體拮抗劑，曾處於治療胃腸道潰瘍的一期臨床試驗，但由於心臟毒性和胃腸毒性於2000年被迫終止。百時美施貴寶開發的組胺H2受體拮抗劑
BMY-25368
曾進入十二指腸和胃潰瘍治療的三期臨床，但也終止了。化合物
4
具有明顯的抗結核活性，但代謝清除率高，當聯用CYP抑制劑時能夠明顯提高其血漿濃度。通常一些方酸衍生物對酶是穩定的，但有些衍生物也可被不同的酶代謝，因此，可進一步探究其代謝機制。
圖：方酸及其衍生物的生物活性
單方醯胺（Squaramates）常用於與賴氨酸和其他胺的生物偶聯；二方醯胺（Squaramides）則可作為核苷酸或寡核苷酸中磷酸基團的替代物。在化學生物學中，方酸類似物能與蛋白質或碳水化合物偶聯，也可作為離子受體。在藥物化學中，方酸類似物具有抗瘧原蟲、抗癌、抗菌，抗病毒等多種生物活性，是開發理想藥物的重要優勢骨架。
抗原蟲活性
原蟲是一種單細胞真核生物，能引起瘧疾、人類非洲錐蟲病、利什曼病、美洲錐蟲病等疾病。許多抗寄生蟲藥物由於耐藥性限制了其廣泛應用，開發新型作用機制的抗原蟲藥物具有必要性，方酸衍生物是其中一類有前景的化合物。
基於方醯胺和氯喹設計的化合物
5
對氯喹耐藥的瘧原蟲具有明顯的抑制活性，其活性是母體藥物氯喹的2倍左右，且在NIH 3T3和HEK293T細胞中沒有毒性。基於氨基喹啉和方醯胺設計的化合物
6
在肝期瘧原蟲感染的人肝細胞Huh7中，其抗瘧活性是標準藥物伯氨喹的7。3倍，是一類新型抗瘧疾化合物。
圖：具有抗原蟲活性的方酸衍生物
利什曼病是一種全世界流行的寄生蟲病，方醯胺化合物
7
具有抗利什曼原蟲活性，活性高於標準藥物
Glucantime
且毒性更低，對原蟲Leishmania infantum的抑制IC50為16。3 μM。
美洲錐蟲病是一種由錐蟲Trypanosomacruzi引起的昆蟲傳播性疾病，方酸衍生物也具有顯著的抗美洲錐蟲活性，方醯胺化合物
8
具有抗美洲錐蟲活性，體內外實驗證明對急性和慢性美洲錐蟲病具有很好的效果，對錐蟲Trypanosoma cruzi的抑制IC50為9。4 μM。另一個方醯胺化合物
9
在體內外均具有抗美洲錐蟲活性，活性高於標準藥物苯硝唑，且毒性更低。機制研究表明
9
能夠使線粒體膜去極化，導致能量不足，進而誘導細胞死亡。
抗菌活性
細菌感染是最大的健康問題之一，越來越多的抗生素耐藥問題，迫切需要新型的抗菌活性化合物。
化合物
10
具有中等到較弱的抗幽門螺旋桿菌活性，這一發現後來推動了有效的組胺H2受體拮抗劑
Pibutidine
的發現。細菌可利用菌毛與宿主細胞連線，I型菌毛介導的甘露糖特異性細菌粘附通常透過凝集素FimH實現。方酸單醯胺甘露糖苷化合物
11
和
12
可抑制I型菌毛介導的甘露糖特異性細菌粘附過程，其中
11
對FimH具有較高的親和力，且活性比標準化合物
pNPMan
高出50倍左右。
圖：具有抗菌活性的方酸衍生物
RNA聚合酶對基因表達、細胞生長和存活至關重要，是重要的抗菌靶點。基於高通量篩選並最佳化獲得的化合物
13
具有很好的抗菌活性，可結合RNA聚合酶開關區域，導致該區域功能失活進而抑制後續轉錄。構效關係研究表明，末端異惡唑和苯環是關鍵基團，可結合開關區域的特異性口袋。
ATP合酶是細菌能量代謝過程的關鍵酶，是有前景的抗菌靶點。化合物
14
是選擇性的結核分枝桿菌ATP合酶抑制劑，具有抗結核分枝桿菌活性，且毒性低，具有貝達喹啉（已上市的ATP合酶抑制劑用於肺結核治療）結構，在貝達喹啉耐藥突變的結核分枝桿菌中沒有出現交叉耐藥。
細胞毒作用
癌症治療一直是研究熱點，對癌細胞產生毒性，同時減少對正常細胞損害是抗癌藥物治療的研究重點。
Pt複合物
14
在T24細胞中具有明顯細胞毒作用，是首個報道具有癌細胞毒性的方酸衍生物，活性不及順鉑，但具有進一步研究的價值。大環方醯胺化合物
15
具有抗癌活性，其中環的大小對抗癌活性至關重要，具有5個方醯胺骨架的
15
具有合適的連線子、合適的構象和柔性，這對於靶標結合能力至關重要。在Jeko-1和Z-138細胞中，具有很好的抗增殖活性，而對正常細胞沒有明顯影響，非環狀寡聚方醯胺和更小（2-4）環方醯胺則沒有活性。
基於微管蛋白抑制劑combretastatinA4（CA4）構效關係的研究，研究人員引入方酸片段作為順式構象限制骨架設計了CA4模擬物
16
和
17
，兩者在白血病細胞CEM中與CA4（IC50=1。6 nM）具有相似的活性。
圖：具有細胞毒作用的方酸衍生物
化合物
18
在多種癌細胞中具有抗增殖活性，在HGC-27細胞中IC50為1。81μM ，在Hela細胞為34。63 μM，其中NH對活性至關重要。
真核翻譯起始因子4E（eIF4E）能刺激與癌細胞生長和轉移有關的蛋白質翻譯，是重要的抗癌靶點，作為真核翻譯起始因子4F複合物的重要組成部分，4F複合物能夠識別mRNA 5’端的7-甲基鳥苷帽結構，化合物
19
和
20
具有中等的eIF4E帽結合抑制活性。
圖：具有細胞毒作用的方酸衍生物
化合物
21
在Hela細胞中具有明顯細胞毒性，IC50為0。88 μM，進一步以熒光基團修飾環丁烯酮骨架獲得的
22
可在細胞核中積累，可用於細胞成像。
抗病毒活性
方酸衍生物的抗病毒活性報道相對較少。Tat蛋白是HIV-1複製和轉錄必須的特異性反式作用因子，是理想的抗HIV-1感染靶標，與其順式作用應答元件TAR RAN結合是發揮功能，參與RNA聚合酶介導的病毒轉錄必修的。研究人員以方醯胺作為胍基的電子等排體設計的擬肽化合物
23
能夠結合TAR RNA（KD=7。7 μM），抑制Tat-TAR相互作用，具有抗HIV活性。
圖：具有抗病毒活性的方酸衍生物
化合物是
24
是另一個具有抗HIV活性的方醯胺衍生物，能抑制HIV-1蛋白酶抑制活性，其對HIV-1蛋白酶的抑制常數Ki=0。51 nM。
其他生物活性
趨化因子受體CXCR1和CXCR2屬於G蛋白偶聯受體（GPCR）超家族成員， 是介導相應趨化因子發揮生物學功能的關鍵受體，可受到生長相關蛋白α（CXCL1）和白介素8（CXCL8）的啟用，選擇性的CXCR2拮抗劑是炎症相關疾病治療的靶點。
圖：方酸衍生物類CXCR2拮抗劑
Navarixin
是一種有效的CXCR2拮抗劑，對CXCR2具有很好的親和力，解離常數Kd為0。049 nM，而對CXCR1的Kd為3。9 nM，目前處於實體瘤治療的二期臨床。
研究人員基於之前的研究，以方醯胺片段作為脲基和N-氰基胍基的電子等排體設計得到化合物
25
具有很好的CXCR2抑制活性和中等PK性質，構效關係研究表明，方醯胺NH和酚羥基對活性至關重要，磺醯胺基則用以調控分子理化性質且對酚羥基沒有明顯影響。利用同樣的策略，另外的研究人員發展了系列具有CXCR2抑制活性的化合物（
26-31
），進一步證明二芳基方醯胺類化合物的苯酚結構在方醯胺左側是優勢骨架。
圖：方酸衍生物類CXCR2拮抗劑
基於二芳基方醯胺化合物的構效關係設計獲得了高親和力的CXCR2拮抗劑
32
，IC50為36 nM，為了避免硝基代謝帶來的副作用，引入醯胺基替換硝基獲得化合物
33
，其體外活性增強，溶解性也增加。進一步最佳化獲得化合物
34
，親和力提高，口服生物利用度很高，當以雜環取代右側的苯環時獲得了最有效的化合物
Navarixin
。
圖：方酸衍生物類CXCR2拮抗劑
方醯胺膽鹼鹽化合物
35
是諾華開發的CXCR2選擇性拮抗劑，可能成為第一個治療慢性阻塞性肺病（COPD）的藥物，其中不對稱方醯胺膽鹼鹽可能有效提高CXCR2拮抗劑的藥物質量。
CGS-19755
是一種有效的NMDA受體拮抗劑，構效關係研究表明分子中磷酸是關鍵藥效團，以方醯胺片段替換α-氨基酸片段設計得到化合物
36
，在幾種神經退行性疾病模型中具有良好的臨床前資料。
圖：方酸衍生物類NMDA受體拮抗劑
蛋白酶啟用受體（proteaseactivated receptors， PARS）屬於G蛋白偶聯受體家族成員，可透過介導細胞外訊號調節激酶（extracellar signal-regulated kiase， ERK1/2）訊號轉道通路，引起細胞核反應，啟用多種細胞轉錄因子，人PAR1參與凝血酶誘導的血小板聚集，PAR1拮抗劑可作為抗血小板活性分子。肉桂香哌嗪
F16357
是一種PAR1抑制劑，以方酸片段作為羰基電子等排獲得的
37
是有效的PAR1拮抗劑，10 μM濃度下具有97%的拮抗活性。
圖：方酸衍生物類PAR1抑制劑
玻連蛋白是一種整合素，屬於血小板糖蛋白組成員，是一種介導細胞和其外環境之間的連線的跨膜受體，化合物
38
是一種玻連蛋白受體（αvβ3）拮抗劑，可用於球囊血管成形術後再狹窄的治療。
G蛋白偶聯受體55（GPR55）定位於脊髓感覺軸突，在神經病理性疼痛、癌症和炎症中起關鍵作用，化合物
39
表現出與內源性配體類似的行為，可調控GPR55活性並抑制背根神經節（DRG）傷害性軸突。
圖：化合物38-41結構
基質金屬蛋白酶（Matrixmetalloproteinase）屬於內肽酶家族成員，因其需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名。基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）幾乎能降解細胞外基質的所有成分，參與機體的大部分生理病理過程，其過表達與多發性硬化、類風溼性關節炎、血管生成和轉移，是相關疾病治療的靶點。基於方酸結構的肽類化合物
40
是一種MMP-1抑制劑，IC50為15 μM。化合物
41
是一種HDAC抑制劑，構效關係研究表明，4-三氟甲基苯基能夠提高活性和改善代謝清除率，而苄基取代則活性降低，具有小取代的脂肪側鏈能夠改善分子溶解性。
乙醯膽鹼酯酶（AChE）是阿爾茲海默症（AD）治療的重要靶點，他克林（Tacrine）是第一個臨床治療AD的AChE抑制劑。方醯胺結合他克林設計的化合物
42
和
43
具有AChE抑制活性，且在HepG2細胞中毒性很低。N-羥基方醯胺衍生物
44
是一種鋅金屬酶ADAMTS-5（骨關節炎治療靶點）抑制劑，IC50為2。6 μM。
圖：化合物42-44的結構
Plk1（Polo-like Kinase 1）屬於Polo樣激酶家族成員，是一類廣泛存在於真核細胞中的絲氨酸/蘇氨酸激酶，Plk1參與細胞分裂，DNA損傷修復途徑，細胞凋亡和細胞週期程序中關鍵步驟的調節，是重要的癌症治療靶點。基於HTS篩選獲得的化合物
45
具有很好的Plk1抑制活性，進一步的構效關係最佳化獲得化合物
46
的活性和PK性質得到明顯提升。
圖：方酸衍生物類Plk1抑制劑
生物電子等排體
生物電子等排體替換是藥物化學中的經典設計策略，對於分子的設計具有重要意義。
方酸片段可作為羧酸、四氮唑、磷酸的生物電子等排體
，例如血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑中的羧酸和四氮唑的電子等排體替換，核苷酸中磷酸基團的電子等排體替換。
圖：方酸及其衍生物片段作為生物電子等排體
氨基方醯胺片段可作為非手性α氨基酸片段和胍基的電子等排體
，例如NMDA受體擬肽拮抗劑設計中用於替換穀氨酸、精氨酸片段。
二級方醯胺可作為脲片段和N-氰基胍片段的電子等排體
，例如CXCR2拮抗劑的設計中的應用。隨著研究的不斷深入，方酸衍生物片段可以作為更多優勢骨架的非經典生物電子等排體用於藥物設計。
總結
方酸衍生物方醯胺、單方醯胺、方酸酯等是結構簡單而有用的分子，雖然其結構很早被發現，但作為潛在的治療藥物研究剛剛開始，原因在於方酸衍生物分子包含高活性基團往往和毒性、非選擇性等副作用相關。隨著方酸及其衍生物研究的深入，藥物化學家發現這類結構具有多種生物活性和特徵，可能在發現新型分子以解決耐藥問題方面實現突破，因此開始受到藥物化學家的關注，相信在未來，方酸及其衍生物會給藥物設計領域帶來更多的驚喜。
參考文獻：
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2。 Jan Chasák， VeronikaŠlachtová， et al。Squaric acid analogues in medicinal chemistry。Eur。 J。 Med。 Chem。
2021
， 209，112872。
