泛素化作為蛋白翻譯後修飾（PTM）的方式之一，不僅參與蛋白質的降解，在調節細胞功能方面也發揮著重要作用。泛素化相關文章發表也呈逐年上升趨勢，且泛素化研究成功躋身於2021國自然醫學部20大熱點之中。
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今天，小編也是閱讀了大量文獻，總結了泛素化的基本知識，泛素連線酶的類別，泛素化的功能，最後以2篇文獻為例來闡述泛素化的功能研究。
泛素（ubiquitin， Ub）是一種由 76 個氨基酸組成的分子量約8。5 kDa 的小分子蛋白質， 廣泛存在於所有真核細胞中， 且序列高度保守， 從酵母到人僅相差 3 個氨基酸。泛素化是指泛素在一系列酶的催化作用下共價結合到靶蛋白的過程。泛素化過程通常需要3種泛素化酶的協同作用：E1 泛素啟用酶、E2泛素結合酶和E3泛素連線酶。
Ubiquitin proteasome system
［Cockram P E ， Kist M ， Prakash S ， et al。 Ubiquitination in the regulation of inflammatory cell death and cancer［J］。 Cell Death and Differentiation， 2021， 28（2）：1-15。］
①在ATP供給能量的情況下，泛素啟用酶E1將泛素分子活化；
②泛素啟用酶E1將活化的泛素分子傳遞給泛素結合酶E2；
③泛素連線酶E3將結合E2的泛素連線到靶蛋白上。
據估計人基因組編碼2種E1s、大約40種E2s和超過600種E3s。根據泛素向靶蛋白轉移的具體結構域的不同，將E3s進一步分為三類： 含HECT結構域的E3s、含RING結構域的E3s以及含 U-box 結構域的E3s。
Three families of ubiquitin-protein ligases （E3s）
［Nakayama H 。 U-box proteins as a new family of ubiquitin ligases［J］。 Biochemical and Biophysical Research Communications， 2003。］
不同的泛素連線酶E3參與形成泛素鏈的機制不同。所有的E3都具有連線靶蛋白和特定E2的能力。HETC結構域家族的泛素連線酶E3s是目前所知的唯一的可以和泛素形成硫酯鍵中間體的泛素連線酶，並且它可以直接催化靶蛋白的泛素化。RING結構域家族最典型的特點是具有環指結構域，RING結構域的氨基酸序列為： Cys-X2-Cys-X（9-39）-Cys-X（1-3）-His-X（2-3）-Cys-X2-Cys-X（4-48）-Cys-X2-Cys （X為任意氨基酸）。U-box家族的泛素連線酶E3是真核細胞蛋白質翻譯後質量控制所必需的。此家族的泛素連線酶CHIP可以與Hsc/Hsp70相互作用，說明U-box結構域E3s可能透過分子伴侶發生作用來識別未摺疊或者錯誤摺疊的蛋白質，從而對蛋白質的質量控制起著重要作用。
HECT and RING E3s work by different mechanisms。
［ Deshaies R J ， Joazeiro C 。 RING domain E3 ubiquitin ligases。［J］。
Annual Review of Biochemistry， 2009， 78（1）：399-434。］
Role of U-box type E3s in the ubiquitylation of unfolded proteins。
［Nakayama H 。 U-box proteins as a new family of ubiquitin ligases［J］。 Biochemical and Biophysical Research Communications， 2003。］
泛素化不僅參與蛋白質數量的調節，不同的泛素化鏈長度（單泛素化、多泛素化以及多聚泛素化）及多種多樣的泛素化鏈型別（連線透過Met1， Lys6， Lys11， Lys27， Lys29， Lys33， Lys48 和 Lys63）在蛋白質活性、蛋白-蛋白相互作用以及蛋白質亞細胞定位中發揮極為重要的調控功能。由於泛素化的多樣性與多價性，泛素化廣泛參與各種生理過程， 包括細胞增殖、凋亡、自噬、內吞、DNA損傷修復以及免疫應答。
The classification of ubiquitination and corresponding biological functions
［Liu J ， Cheng Y ， Zheng M ， et al。 Targeting the ubiquitination/deubiquitination process to regulate immune checkpoint pathways［J］。 訊號轉導與靶向治療（英文）， 12（2）：11。］
泛素化與細胞凋亡
Ubiquitination and degradation of the FADD adaptor protein regulate death receptor-mediated apoptosis and necroptosis
FADD 接頭蛋白的泛素化降解調節死亡受體介導的細胞凋亡和壞死性凋亡
Fas 相關蛋白與死亡域 （FADD） 是死亡受體介導的外在細胞凋亡和壞死性凋亡的關鍵組成部分。本文表明 FADD 受 Makorin 環指蛋白 1 （MKRN1） E3 連線酶介導的泛素化和蛋白酶體降解的調節。 MKRN1 敲低導致 FADD 蛋白穩定並形成快速死亡誘導訊號複合物，透過促進 caspase-8 和 caspase-3 裂解以響應死亡訊號，從而導致對外在細胞凋亡的超敏反應。文章還表明 MKRN1 和 FADD 參與了 caspase 抑制後壞死體形成和壞死性凋亡的調節。在使用 MDA MB-231 乳腺癌細胞的異種移植模型中，在腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體治療後，MKRN1 的下調導致腫瘤生長的嚴重缺陷。同時 FADD 敲低可解除 MKRN1 耗竭對腫瘤生長的抑制。文章揭示了一種新機制：透過泛素化誘導的降解途徑調節具有死亡結構域的fas相關蛋白。
敲低MKRN1，加速了死亡誘導訊號複合體（DISC）的形成，促進caspase 8介導的外源性細胞凋亡。
MKRN1敲低顯著降低了FADD 泛素化，表明 MKRN1 介導了 FADD 泛素化。MKRN1透過介導FADD泛素化降解負調控死亡受體介導的細胞凋亡。
L929小鼠成纖維細胞中，敲除MKRN1顯著增強壞死性細胞死亡，而nec-1可以逆轉此現象。敲除MKRN1，用mTNFα 和 z-VAD-fmk處理細胞，可以發現 RIP1–RIP3–FADD複合體的形成。說明當細胞凋亡途徑被抑制時，MKRN1 耗竭透過增加壞死體複合物的形成來促進壞死性凋亡。
FADD 消耗顯著引起了RIP1-RIP3 複合物的增加，表明在MKRN1耗竭的細胞中，FADD敲除會進一步加強壞死性細胞死亡。即使 FADD 敲低，MKRN1 耗竭也會增加壞死體形成和壞死性凋亡，表明 MKRN1敲低以獨立於FADD 的方式增強壞死性凋亡，但 MKRN1 敲低後的 FADD穩定可以延緩壞死性細胞凋亡。
泛素化與細胞自噬、細胞代謝
在哺乳動物細胞中，ULK1和PI3K-III激酶複合物是負責自噬啟動和自噬小體形成的兩種主要蛋白。泛素連線酶TRAF6介導k63連線泛素鏈的形成，在誘導自噬中起重要作用。TRAF6促進ULK1的K63 泛素化，從而增強ULK1的穩定性和功能。另外，TRAF6還催化Beclin-1 K63的泛素化。Beclin-1 泛素化發生在BH3結構域，從而阻斷Beclin-1與Bcl-2相互作用，從而促進自噬反應。
與TRAF6和AMBRA1不同，泛素連線酶NEDD4和RNF216分別透過形成K11和K48泛素鏈，促進Beclin-1蛋白酶體降解。K63泛素化在應對應激條件或透過反饋機制加速自噬啟動時促進自噬的發生，而K48-和K11-泛素化則透過降解自噬核心蛋白阻止自噬的發生。
Functional roles of ubiquitin ligases in regulating autophagy
［Chen R H ， Chen Y H ， Huang T Y 。 Ubiquitin-mediated regulation of autophagy［J］。 Journal of Biomedical Science， 2019， 26。］
VPS34 K29/K48 branched ubiquitination governed by UBE3C and TRABID regulates autophagy，proteostasis and liver metabolism
由UBE3C和TRABID調控的VPS34 K29/K48鏈泛素化調控自噬、蛋白質穩態和肝臟代謝
文章展示了泛素連線酶UBE3C和去泛素化酶TRABID相互調節VPS34的K29/ k48鏈泛素化，發現這種泛素化增強VPS34與蛋白酶體的結合降解，導致自噬抑制。在內質網和蛋白毒性脅迫下，UBE3C招募到吞噬體被抑制，但卻加強了其與蛋白酶體的結合。這個開關削弱了UBE3C對VPS34的作用，從而提高自噬活性，以促進蛋白質穩態和細胞存活。特別是在肝臟，我們發現TRABID介導VPS34的穩定對脂質代謝至關重要，且在脂肪變性的病理發生過程中下調。本研究確定了VPS34的泛素化型別，並闡明瞭其在蛋白質穩定和肝臟代謝中的細胞命運和生理功能。
敲除TRABID，發現無論是在DMEM培養基還是在EBSS培養基中培養細胞，自噬體的形成及LC3酯化程度均減弱，但不影響P62的積累。即使用巴弗洛黴素A1阻止自噬流的發生，也會得到相同的結果。過表達TRABID，在DMEM培養基或EBSS培養基中培養細胞，或使用巴弗洛黴素A1處理，均可發現LC3的酯化程度升高。
說明TRABID可以促進自噬體的形成。
在VPS34複合物的亞基中，TRABID過表達降低了轉染和內源性VPS34的泛素化水平。研究TRABID影響的泛素化型別發現，單獨的K29R和K48R泛素鏈突變僅削弱TRABID引起的VPS34去泛素化，而 K29R/K48R雙突變泛素鏈完全消除了TRABID引起的VPS34去泛素化作用。僅K29/48泛素鏈即可使TRABID誘導的VPS34去泛素化類似野生型效果。另外用K48泛素鏈特異性抗體證明TRABID，而非其CS突變體，可以去除VPS34的K48連結的泛素鏈。另外，體外實驗證明
TRABID透過去除VPS34的K29和K48連線的泛素化來維持VPS34蛋白穩定，以促進自噬泡的成熟。
實驗證明UBE3C和VPS34存在相互作用。敲除UBE3C，VPS34泛素化減弱；過表達UBE3C，VPS34泛素化增強。在對UBE3C使VPS34泛素化形成的泛素鏈型別研究發現，突變K29/K48泛素鏈，VPS34泛素化被抑制。單獨的K29或K48泛素鏈，可以部分維持UBE3C對VPS34的泛素化作用，而K63泛素鏈沒有此功能。雙突變的K29和K48泛素鏈抑制了UBE3C對VPS34的泛素化作用。體內體外實驗證明了
UBE3C催化VPS34形成K29-或K48-泛素鏈。
敲除UBE3C，促進VPS34的表達及LC3的酯化，說明UBE3C抑制自噬泡的形成和成熟。UBE3C和VPS34雙敲除實驗可以逆轉此現象。說明在基礎或者飢餓條件下，
UBE3C和VPS34共同調節VPS34的穩定性，這對維持自噬活性的平衡非常重要。
為了探索TRABID介導的VPS34在肝代謝中的作用，作者用高脂肪飲食（HFD）建立非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠模型。HFD降低肝自噬活性，減少LC3酯化，且發現VPS34和TRABID表達量明顯減少，說明遊離脂肪酸降低TRABID的表達。
rAAV-TRABID治療4周後，VPS34表達量升高，自噬活性增強，且明顯降低高脂飲食引起的體重增加。
另外，透過檢測肝臟中 p-IRE1和p-PERK水平，說明
rAAV-TRABID可以降低HFD導致的內質網應激反應。
綜上所述，本研究在關鍵自噬調節因子VPS34上發現了此前未被發現的K29/ k48支鏈泛素化，並識別了相互控制該泛素化的酶UBE3C和TRABID。闡明瞭這種泛素化增強的蛋白酶體降解命運，揭示了這種泛素化對內質網、蛋白質質量控制和肝臟代謝的影響。
總之，泛素對細胞的生命活動不可或缺。儘管泛素發現已有半個多世紀，與泛素相關的研究成果也層出不窮，但是由於泛素化的複雜性，人們目前的認知只是冰山一角，很多問題仍有待研究。目前，泛素連線酶E3作為泛素化傳遞鏈的最後一步，其底物仍是該領域研究的熱點。由於E3和底物之間複雜的交叉作用，傳統的基因敲除、RNAi等技術，很難實現更深入的研究。今年來，基於質譜的蛋白質組學發展迅速，成為了研究細胞訊號轉導中蛋白質的強大工具，已用於蛋白質翻譯後修飾等多個領域。此技術將有助於研究細胞不同生命活動中差異顯著的蛋白質的性質，如蛋白質丰度、蛋白質間相互作用、蛋白翻譯後修飾等，瞭解這些變化的規律將有助於精確定位泛素化靶點，並針對性治療相關疾病。
