01
要點概括
1。神經元體外活細胞成像已成為了解大腦發育和功能的關鍵方法。神經元發育的動態過程，如神經突起和生長錐的形成，以及細胞內細胞器的運輸，在建立資訊傳輸所需的複雜3D神經網路方面起著至關重要的作用。
2。大多數研究使用基於熒光的成像，這會產生大量的光毒性，限制成像頻率或實驗持續時間，並且會對神經突等脆弱結構造成實質性損害，從而在實驗中引入偽影，導致資料不準確。
3。 Nanolive實現了神經元活細胞無標記成像，由於在極低功率下使用相干光干涉，因此不會產生光毒性，從而可以在不干擾細胞活動、形態或行為的情況下研究活體神經元中的複雜動態過程。
02
Nanolive在神經元研究方面的應用
Nanolive活細胞成像在神經生物學方面的潛力巨大，下面列舉三個案例。
案例1研究顯示了未分化初級皮質神經元暴露於神經軸突刺激介質後發生的形態學變化的時間線。高精度分割法用於計算感興趣的細胞指標（例如體積、形狀和乾重）。這些計算與在單個神經元中觀察到的行為直接相關。
案例2和案例3研究集中於幹細胞在神經分化過程中經歷的亞細胞形態變化。這在單細胞（案例2）和群體水平（案例3）上都得到了檢驗。我們希望本應用描述將有助於激勵研究人員利用奈米活細胞成像技術徹底改變他們的研究。
案例一：原代皮層神經元軸突生長動力學的定量研究
背景：
在發育過程中，神經元建立細胞間通訊所需的過程（神經突）需要經歷複雜的形態變化，包括生長錐的形成、軸突的規格變化和分支。神經元形態的細微異常與幾種神經退行性疾病的發生有關；將異常神經元的從充滿異質性行為的正常的神經元中區分開來需要對軸突生長動力學有詳細的瞭解。在這個案例研究中，我們展示了Nanolive活細胞成像為監測神經元發育提供了一個完美的解決方案。
試驗方法：
Step1：未受刺激的人皮質神經元細胞（hCN2，ATCC，USA）在DMEM培養基+10% FBS中單層生長，青黴素（20單位/毫升）和鏈黴素（20毫克/毫升）。溫度（37°C）和氣體（5%CO2）為保持不變。對未受刺激的細胞進行成像。
Step2： 新增神經軸突刺激培養基（25 ng/mlβ神經生長因子、0。5 mM dbcAMP和0。5 mM IBMX），並在新增培養基後20 h、3 d、9 d和20 d對細胞進行再次成像。使用Nanolive的3D Cell Explorer，以6s/張頻率採集影象。
Step3： 使用內部開發的工具對生成的影象進行最大強度z投影、分割（細胞體顯示為綠色，神經突顯示為橙色，分開）和量化。
試驗結果：
1.未受刺激的初級皮質神經元暴露於神經軸突刺激介質後的形態學變化的時間表
在下圖中，顯示了每個實驗時間點的一幀（頂行），以及它的相應的分割影象（底行），其中細胞體顯示為綠色，神經突起顯示為橙色。
a。未受刺激的細胞具有典型的未分化形態；平的，三角形的，並且很好地分佈在培養皿的表面。明亮的圓形小泡充滿細胞質，含有神經元物質。
b。刺激後20h，細胞仍然散佈在培養皿表面，但已形成第一個神經軸突（分割影象中為橙色）。
c。刺激後3d，細胞已形成高階生長錐，具有複雜的分枝形態。
d。刺激後9d，細胞開始呈現典型的神經元形態；細胞體已經收縮，五個神經突起已經形成。
e。在刺激後20d，細胞出現了多極生理學，有四個清晰、細長的神經突起。
*分割模型的高精度；沒有遺漏任何細節。精細的突起、棘突和靜脈曲張都被高精度捕獲，證實了Nanolive活體成像可以用來監測神經元的精細形態變化。
2.以高精度視覺化和量化動態行為的精細尺度
在本例中，我們量化了新增刺激介質20h後生長的初級神經軸突的動態行為
a。Nanolive活體成像的高解析度和高精度檢測神經軸突體積和形狀的變化。神經軸突面積（A）、周長（B）和幹質量（C）的大幅波動反映了這些變化的速度和動態性。
b。氣泡圖（例如，氣泡大小代表幹質量的D）可用於調查三個變數A、B和C之間的關係。
3.調查新行為觀察的潛在原因
兩個細胞在加入神經軸突刺激培養基後3d成像。高時間解析度Nanolive活體成像技術的發展使我們能夠捕捉到一種新的細胞脈衝行為。這裡，我們檢查一個脈衝單元中的單元度量。
a。據我們所知，這是首次在初級皮質神經元中觀察到脈衝。這一現象在影片中更為清晰，但即使在上面的靜止影象中，隨著細胞收縮，細胞體的形狀也發生了明顯的變化。
b。細胞指標準確反映影片中捕獲的行為。例如，細胞體在膨脹時積累幹物質，然後在收縮時幹物質急劇減少，然後趨於穩定（A），而在神經突起的幹物質中觀察到相反模式（B）。
c。細胞體與神經突面積之比的峰值（C）表明，這可能是細胞注射物質（從而生長）其神經突的方式，儘管這一假設需要透過額外的實驗加以證實。
d。未來可能在更長的時間內監測神經元，以確定這些脈衝事件是否是週期性的，並計算收縮之間經過的時間。
4.檢查神經突的形態可塑性，確定細胞物質在神經突之間的分佈
a。我們像以前一樣對生長錐進行了分割，但這次我們進一步進行了分析，為每個神經突添加了一個唯一的物件識別符號，並跟蹤幹質量隨時間的變化。
b。右側的圖表顯示，某些神經軸突的幹質量波動比其他神經軸突大，波動的幅度不一定與神經軸突的大小有關。
c。這種型別的分析可用於研究神經軸突隨時間變化的形態可塑性，並確定a）細胞材料在神經軸突之間的分佈情況以及b）哪些神經軸突正在生長/收縮。
5.量化形狀隨時間的複雜變化
在影片中，在新增神經軸突刺激9d後成像的細胞在形狀上經歷了複雜的變化。這裡展示了準確量化這些變化的可能性。
a。從未受刺激的細胞（左）到神經突刺激後20d（右），細胞細胞質中存在小泡（含有神經元物質）。
b。未來會量化神經元內或神經元之間細胞內轉運的內容或動力學。
結論
1。本案例研究中所做的許多觀察都是新的，Nanolive提供了一種非侵入性、無標籤的選擇，用於脆弱的細胞如神經元的研究。
2。這些觀察結果為研究開闢了新方向，本案例的研究展示了大量有待開發的定量資訊。
案例二：單細胞水平上的幹細胞向神經定向分化
背景
Nanolive的顯微鏡為科學家提供了實時監測幹細胞分化過程中發生的亞細胞形態變化的機會。該案例分析了間充質幹細胞（MSC）在神經源性分化培養基中發生的形態學變化。
試驗方法
Step1：人臍帶基質間充質幹細胞在完全神經源性分化培養基中培養13d後分化。
Step2：使用3D Cell Explorer對細胞成像20h，採集頻率為30s/張。
觀察內容
1。這是第一次實時拍攝活幹細胞分化過程中的畫面。
2。Nanolive提供了細胞發生形態變化的高解析度亞細胞影象：
A。細胞具有正常、健康MSC的形態；細胞質延長，細胞核可見
B。肌動蛋白細胞質開始收縮（折射率的增加使細胞看起來更亮）
C。細胞濃縮成長方體。然而，它仍然透過四個埠與相鄰單元相連形成細長突起
D細胞發育出分支的原生質延伸，類似樹突，以快速、隨機的方式延伸和收縮。可以觀察到小泡在拉長的突起內移動（正在運輸）。
3。這樣的觀察可以徹底改變我們對幹細胞分化過程中細胞形態、代謝活性和反應性變化的理解。
案例三：群體水平上的幹細胞神經分化
背景
在本案例研究中，使用Nanolive下一代自動化顯微鏡CX-A對幹細胞分化的觀察從單細胞水平擴充套件到人群水平。CX-A的大視場（高達1 mm2）、多種成像模式和簡單而高效的離體技術為罕見和不可預測的細胞事件（如分化）成像提供了一個強大的解決方案，具有高空間解析度，並且不影響3D Cell Explorer的細胞器級解析度。
試驗方法
臍帶基質人MSC在塗有纖維連線蛋白的CX-A相容的35 mm玻璃底培養皿中培養4d。然後將培養基切換到神經源性分化培養基（PromoCell，德國）2d，然後開始成像。採用5×5網格掃描模式，以每4。5min/張的頻率自動採集影象，持續22h。生成的影象沿Z軸進行最大投影，然後縫合在一起生成影片。
上面的示意圖顯示了兩種可能的幹細胞譜系在暴露於神經源性分化線索後可以發生的變化。神經細胞只能由神經祖細胞生成，而星形膠質細胞和少突膠質細胞則由膠質祖細胞生成。
觀察內容
1。無標籤和光毒性技術的非侵入性意味著非常敏感的細胞事件，如干細胞分化，可以長期成像，無需處理干擾。
2。CX-A的廣闊視野允許在群體水平上評估細胞表型和形態的多樣性。監測多個細胞的反應會給實驗帶來更大的統計意義，並最大限度地增加觀察罕見事件的機會。
3。高解析度使我們能夠觀察到極其精細、脆弱的結構，如細胞之間的接觸點。
4。利用該技術，可以根據細胞形態特徵識別神經分化過程各個階段的細胞。
觀察步驟
Step1：肌動蛋白細胞骨架收縮
當細胞開始發育出神經元形態時，它會收縮並失去與鄰近細胞的聯絡。這個過程發生得有多快？細胞的大小/體積/質量的平均變化是多少？分化細胞與多少細胞保持連線？什麼時候切斷聯絡點？Nanolive高空間解析度為解決時間線的精細細節提供了可能性。
Step2：液泡形成
Nanolive高空間解析度第一次能夠捕捉到分化過程中液泡的形成。這個過程在分化中的意義是什麼？細胞是否可以回收舊的成分以適應新的細胞功能？量化簡單與細胞大小/體積/質量相關的空泡數量等指標可以揭示這種現象的重要性。
第二點涉及液泡形成的空間分佈；影象顯示，液泡在細胞的外圍形成，然後向細胞的中心移動。繪製液泡的空間分佈圖並追蹤它們的運動可能是有意義的。
Step3： 軸突延長
軸突的伸長方向與發育中的細胞體相反。這種增長有多快？軸突的直徑在生長過程中會發生變化嗎？在發育中的軸突末端，我們觀察到一個小的手指狀突起，似乎探測到它前面的表面。這個結構可能是突觸末端嗎？在發育過程中，我們觀察到樹突的丟失和小泡沿著軸突流向生長區；這可能是被運輸到生長區的用於再生樹突狀的材料嗎？
結論
1。本案例研究中的所有資料都是從CX-a上拍攝的單個影片中獲得的，突出了資料的豐富性。
2。Nanolive為研究細胞提供了無創、無標籤的選擇，不受外界干擾。
3。這些觀察結果為研究開闢了幾個有趣的新方向並展示了大量有待開發的定量資訊
03
參考文獻
1。Knowles， R。 B。 et al。 Plaque-induced neuriteabnormalities： implications for disruption of neural networks in Alzheimer’sdisease。
Proc。 Natl。Acad。 Sci。
96（9）， 5274-5279。 （1999）。
2。Nagy， J。 et al。 Altered neurite morphology andcholinergic function of induced pluripotent stem cell-derived neurons from apatient with Kleefstra syndrome and autism。
Transl。 Psychiatry。
7（7），e1179-e1179。 （2017）。
3。Wissner-Gross， Z。 D。 et al。 Large-scale analysisof neurite growth dynamics on micropatterned substrates。
Integr。 Biol。
3（1）， 65-74 （2011）。
NanoLive 3D Explorer是由瑞士 Nanolive 公司於2014年在中國推出的一款實時無標記活細胞斷層掃描3D顯微鏡，NanoLive 3D Explorer（簡稱3D顯微成像系統）整合全息技術及旋轉掃描技術為一體，無需任何標記即可對細胞在200nm 尺度上進行3D結構探索，並能進行一系列量化實驗，如細胞遷移、胞內囊泡追蹤、亞細胞器定位、細胞或微生物體積測定、細胞骨架、微絲等無標記分析。
不同於傳統的細胞成像需要固定並染色，使用實時無標記活細胞斷層掃描3D顯微鏡幾乎不需要樣品製備，採用非入侵式、無標記成像，利用任何細胞組分不同折射率的透光資訊，對細胞組分進行數字化“染色”，可輕鬆區分細胞核、細胞質和細胞器。
由於無需任何標記物，不用擔心熒游標記對細胞二次影響，透過連續觀測可提供在生理條件下活細胞更多的變化資訊，從而為生命本質活動研究提供探索工具。
可搭載載臺式孵育系統，在不干擾細胞自然生理機能的條件下研究細胞生長、分化、死亡的生命週期，可連續觀察細胞幾秒到數週，以每秒的速度實時追蹤細胞各個結構和它們的機動性與動態性。
3D Explorer整合了完整的活細胞3D成像技術，首次亮相2014年ASCB會議時就一舉獲得眾多業內人士好評，從技術上引領了當前生命科學研究的前沿熱點。
主要獲獎情況：
昆明納瑞科技有限公司
